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VivaTome
시료 중 초점이 정확히 맞는 부위의 optical section을 얻어내는 방법에는 다양한 방법이 있으며, 가장 대표적인 방법으로는 공초점 (confocal) 현미경이 있습니다. 공초점 현미경처럼 광원으로 레이저, detector로 PMT를 사용하지 않는 보다 저렴하고 간편하게 optical section을 할 수 있는 “VivaTome” 이란 장비가 출시되었습니다.
1. VivaTome 의 원리
VivaTome은 aperture correlation의 원리를 이용합니다.
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| Fig. 1 VivaTome Optical Beam Path |
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excitation 광원이 grid 패턴의 spinning disk를 통과하고 시료를 맞은 후 나오는 emission 광원이 다시 spinning disk를 만나 50%는 통과되고 50%는 반사됩니다. 여기서 spinning disk는 공초점 현미경의 pinhole의 역할을 합니다. CCD 카메라에 맺히는 raw data를 이용하여 subtraction 과정을 거치면 정확히 초점이 맞는 optical section을 얻게 됩니다.
2. Optical section calibration
Raw data 이미지 중 CCD 왼쪽에는 spinning disk를 통과한 emission이 맺히고, 오른쪽에는 spinning disk에서 반사된 emission이 맺히게 됩니다. spinning disk를 통과한 왼쪽 이미지는 pinhole을 통과하였지만 아직까지 optical section에 초점이 흐린 이미지가 섞여 있으므로, 이를 subtraction 하기 위해 오른쪽의 반사된 이미지를 이용하여 계산을 해주게 됩니다.
Optical Section
I1 - k*I2 = Isectioned
Conventional Widefiled
I1 + k*I2 = Iwidefield
(*k = a constant that corrects differences in the light efficiency of the two imaging pathways)
3. VivaTome의 장점
- Axio Imager, Axio Observer, Axio Examiner, Axiovert 200 등 Carl Zeiss의 다양한 현미경에 장착 가능
- 일반 형광광원 그대로 이용
- 최대 30 f/s의 빠른 frame rates로 live cell application에 적합
- 각각의 application에 맞추어 두개의 다른 grid 패턴 중 선택
- AxioVision 소프트웨어에서 컨트롤
4. Applications
- Subcellular dynamics in 2D or 3D with high temporal resolution
- Cytoskeleton 관찰
- Membrane transport
- Ion concentrations
- Membrane potential
- Membrane organization
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| Fig. 2 Cultured neuronal cells labelled with BCECF, sectioned(좌), widefield (우). 63x/1.0 W Plan-APOCHROMAT, maximum intensity, Eva Ruusuvuori, University of Helsinki, Finland. |
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