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1. SIM (Structured Illumination Microscopy)
2. PAL-M (PhotoActivation Localization Microscopy)
Super Resolution Technology
현재까지 광학 현미경 해상도의 한계는 200nm정도로 알려져 있습니다. 이는 Abbe박사의 해상도의 공식(D=2NA/λ )의해서 정의되는데, 공식에 의하면 개구수가 가장 높은 100x oil 렌즈를 사용하여 흔히 사용하는 녹색 파장의 예를 들때 약 0.2um의 해상도를 가지게 됩니다.
이러한 한계를 우회적으로 극복한 기술을 바로 Super resolution 기술이라 하며 현재까지 여러 기술들이 개발되었으나 여기서는 가장 대표적인 기술인 SIM 과 PAL-M에 대해서 설명하고자 합니다.
1. SIM (Structured Illumination Microscopy)
1) 원리
아래의 그림과 같이 2개의 grid들이 다른 각도로 겹쳐질 때 겹쳐지는
부위에 또 다른 패턴이 나타나게 됩니다. 이것을 모아레 패턴(Moire pattern)이라 부르고 있는데 SIM은 이 원리를 이용한 것입니다.
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| Fig. 1 겹쳐진 grid에 의해 형성된 모아레 패턴 (Moiré patterns) |
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이 모아레 무늬(Moire fringes)에 기존에 볼 수 없었던 다른 정보를 얻을 수 있게 되며 이 정보는 알고리즘에 의하여 계산되어 해상도를 향상 시킬 수 있습니다.
이와 같이 SIM은 알고 있는 pattern을 이미지로 투영하게 되고 grid를 이용하여 모아레 무늬(Moire fringes)를 만들게 한 후 컴퓨터로 계산하게 되면 광학의 해상도 이상의 해상력을 얻게 됩니다.
2) SIM의 해상력
SIM은 기존의 광학의 해상도의 약 2배정도의 향상을 보입니다. 다시 말해, 기존의 광학의 최고 해상도가 XY는 200nm, Z는 500nm인 반면, SIM은 XY 100nm, Z는 250nm의 해상도를 갖게 됩니다. 이는 sample에 따라 약간의 차이가 있을 수 있습니다.
3) SIM 응용
SIM은 일반 Confocal 현미경에 비해 2배 이상의 해상도를 갖고 있으며 일반 형광 dye를 모두 사용할 수 있는 장점을 가지고 있습니다. 또한 confocal과 같이 Z축으로 이미지를 얻어서 3D imaging을 할 수 있는 장점이 있습니다. 그러나 3 이상의 grid를 rotation을 하여 이미지를 얻어야 하기 때문에 아주 빠른 speed를 낼 수는 없습니다.
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Fig. 2 SR-SIM 이미지 (우)와 Widefield 이미지 (좌).
Neuronal growth cones. Staining for tubulin (red) and F-actin (green). Specimen: M. Fritz and M. Bastmeyer, University of Karlsruhe, Germany |
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2. PAL-M (PhotoActivation Localization Microscopy)
1) 원리
현미경상으로 점 형태의(point-like object) 형광을 이미징하게 될 때 실제의 크기보다 확장된 형태의 이미지를 보게 되는데 이를 PSF(Point Spread function)라고 부릅니다.
2개의 점이 매우 가깝게 위치하게 되면 그것의 PSF가 겹치게 되어 2개의 점의 위치를 정확히 알 수 없게 됩니다. 하지만 2개의 점을 차례로 볼 수 있다면 2개의 PSF의 중앙의 위치를 찾는 것이 가능해집니다.
PAL-M은 photo-switchable dye를 이용하여 한번에 모든 형광분자를 excitation 시키지 않고 따로 따로 excitation 시킴으로서 PSF 중앙의 위치를 파악할 수 있게 합니다. 이 과정을 반복함으로써 모든 PSF 중앙의 위치를 알 수 있게 되고, 이 모든 정보들은 컴퓨터로 계산되어 super resolution image를 얻을 수 있게 됩니다.
2) PAL-M의 해상력
PAL-M의 해상도는 1개의 PSF의 실제크기인 약 20-30nm의 해상도를 가질 수 있습니다. 이는 일반 광학 해상도의 약 10배 이상으로 거의 단일형광 분자 수준의 해상도를 가질 수 있다는 의미입니다. Z축의 해상도는 TIRF 주사방식을 이용하기 때문에 60-100nm의 해상도를 가집니다.
3) PAL-M의 응용
PAL-M은 광학의 10배이상의 해상도(20nm)를 가짐으로써 이를 통해 기존에 구별이 불가능했던 구조를 이미징 할 수 있게 되었습니다. 이는 형광을 이용하면서 전자현미경의 해상도의 이미지를 얻을 수 있는 매우 큰 장점을 가지게 됩니다. 하지만 여기파장의 주사 방식이 TIRF를 이용하기 때문에 glass표면에 가까이 있는 부분만을 볼 수 있는 한계가 있습니다. 또한 한 장의 이미지를 얻는데 오랜 시간이 걸리기 때문에 live cell실험은 아직까지 불가능합니다.
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Fig. 3 TIRF 이미지 (좌)와 PAL-M 이미지 (우)
antibody staining for tubulin in a cultured cell. Specimen: S. Niwa, University of Tokyo, Japan. |
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3. 결 론
지금까지 소개된 'Super Resolution' 기술은 이제까지 불가능 하다고
생각했던 광학의 한계를 극복함으로써 그동안 볼 수 없었던 세포안의 미세구조와 조직의 고해상도 형광 이미지를 얻을 수 있게 하였습니다. 이 새로운 기술들은 현재의 형광 현미경 및 confocal현미경과 전자현미경의 gap을 이어주는 매우 혁신적인 기술임이 분명합니다.
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Superresolution - ELYRA
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