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| Protein-protein interaction 및 modification를 확인하는 새로운 기술 |
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단백질 사이 상호 작용은 외부 신호를 세포 내로 받아들이는 기능 등의 많은 생물학 기능을 위해 중요합니다. 이러한 단백질간의 상호 작용을 연구하기 위해서 현재 Co-localization, Co-immunoprecipitation, BRET, FRET 등 다양한 방법이 사용되고 있습니다. 그러나 현재 사용되는 방법중 BRET와 FRET는 원하는 단백질의 상호 작용을 보기 위해 인위적으로 target 단백질을 overexpression시켜야 하므로 endogenous protein, 즉 세포 내에 존재하고 있는 단백질의 상호 작용을 바로 볼 수 없다는 단점을 가지고 있습니다. 또한 Co- immunoprecipitation 방법은 세포 내에 존재하는 단백질을 상호 작용을 볼 수 있으나 세포 내에서는 바로 볼 수 없다는 단점을 지니고 있습니다. 마지막으로 Co-localization을 세포 내 단백질의 상호 작용을 직접 세포 안에서 볼 수는 있으나 직접적으로 상호 작용을 하는지에 대한 직접적인 증거가 될 수는 없습니다.
기존의 분석 방법들의 단점을 보안 할 수 있은 Duolink Proximity Ligation Assay는 세포나 조직안에서 발현되는 endogeneous Proteins들의 상호 작용이나, post-translational modification등을 확인하기 위해, transfection을 통한 단백질의 over expression 과정 없이도 antibody에 binding된 PLA probe(proximity ligation assay probe)와 Rolling circle DNA amplification을 이용하여 간편하고 빠르게 protein interaction이나 phosphorylation을 확인할 수 있습니다.
Duolink Proximity Ligation Assay Technology
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1. 상호 작용을 하는 두 개의 단백질에 서로 다른 종의 primary antibody를 binding 시킨다.
2. First antibody에 결합하는 PLA probe가 binding 되어 있는 서로 다른 종의 second antibody를 binding 시킨다.
3. PLA의 probe에 상보적인 oligomer를 넣어 Hybridization 시킨다
4. 이렇게 hybridization 된 oligomer를 ligase로 liagation 하여 circular 형태로 만든다.
5. 이 circular DNA로 Rolling circle amplification을 유도한다.
6. Amplification된 DNA에 dye가 있는 oligomer를 Hybridization 시켜 상호 작용을 확인한다. |
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Duolink Proximity Ligation의 Applications
1. Protein-protein Interaction의 확인
예) TGF-β stimulation에 의한 SMAD complex formation
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| Untreated MEF cells | TGF-β treated MEF cells |
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2. Protein phosphorylation의 확인
예) PDGF β receptor 의 Phosphorylation 확인
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| Untreated BJ hTert cells | PDGF-BB stimulated BJ hTert cells |
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3. Single Protein의 detection 및 quantification
IF와 Duolink를 이용한 protein quantification
| Negative control, no primary Ab | Primary Ab against EGFR |
DuoLink |  |  |
IF |  |  |
Reference
1 Kii I, Incorporation of tenascin-C into the extracellular matrix by periostin underlies an extracellular meshwork architecture. J Biol Chem. 2009 Nov 3.
2 Hasumi Y, Baba M, Ajima R, Hasumi H, Valera VA, Klein ME, Haines DC, Merino MJ, Hong SB, Yamaguchi TP, Schmidt LS, Linehan WM. Homozygous loss of BHD causes early embryonic lethality and kidney tumor development with activation of mTORC1 and mTORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Nov 3;106(44):18722-7. 3 Leuchowius KJ, Jarvius M, Wickström M, Rickardson L, Landegren U, Larsson R, Söderberg O, Fryknäs M, Jarvius J. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation. Mol Cell Proteomics. 2009 Oct 27.
4 Szado T., Vanderheyden V., Parys JB., De Smedt H., Rietdorf K., Kotelevets L., Chastre E., Khan F., Landegren U., Söderberg O., Bootman MD., Roderick HL. Phosphorylation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors by protein kinase B/Akt inhibits Ca2+ relea Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 19;105(7):2427-32. Epub 2008 Feb 4.
5 Soderberg, O., Gullberg, M., Jarvius, M., Ridderstrale, K., Leuchowius, K. J., Jarvius, J., Wester, K., Hydbring, P., Bahram, F., Larsson, L. G. & Landegren, U., Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat. Methods, 2006.
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